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Sequençage ADN


Le séquençage d'un ADN consiste à déterminer la succession des nucléotides qui le composent. C’est aujourd hui une technique de routine pour les laboratoires de biologie.

Le séquençage utilise des enzymes particulières, les ADN polymérases qui sont capables de synthétiser un brin complémentaire d'ADN, à partir d un brin matrice lorsqu’on ajoute au milieu des désoxyribonucléotides (dNTP : désoxyNucléotide TriPhosphate).

Pour le séquençage, on utilise des nucléotides particuliers appelés didésoxyribonucléotides (ddNTP). Les ddNTP diffèrent des dNTP par l'absence d'un groupement OH bien précis. En effet, lorsqu'une ADN polymérase utilise un ddNTP au lieu d'un dNTP, elle n'est plus capable de rajouter le moindre nucléotide à sa suite : la synthèse du brin d ADN est stoppée..

Les techniques de séquençage se basent sur ce phénomène.

On procède de la façon suivante :

une ADN polymérase synthétise le brin complémentaire de l'ADN à séquencer.

Dans le milieu de réaction se trouvent des dNTP en grand nombre, et une faible proportion d un ddNTP (à Adénine, ou Guanine, ou Thymine, ou Cytosine). A un moment totalement aléatoire, un ddNTP est ajouté à la chaîne en cours de synthèse par l'ADN polymérase. Cette synthèse s'arrête donc à cet endroit.

Par exemple, si le milieu réactionnel contient une faible proportion de didésoxyribonucléotide à Guanine (ddGTP), on obtiendra à la fin des réactions un ensemble de brins d ADN de tailles différentes, selon l'endroit où un ddGTP se sera inséré et que la réaction aura ainsi été stoppée (ce qui correspond, du fait de la complémentarité des bases, à la présence d une Cytosine dans le brin d ADN séquencé).

On répète la même opération avec un milieu contenant du ddATP, un milieu contenant du ddCTP, et un milieu contenant du ddTTP.

Il ne reste plus qu'à "lire" la séquence : on fait migrer tous ces fragments sur un gel, afin de les séparer selon leur taille. Au niveau d'une "ligne" du gel correspond une taille (précise au nucléotide près) du fragment d'ADN. Afin de lire les quatre nucléotides de l'ADN, on fait migrer séparément les fragments issus des quatre mélanges réactionnels (à ddATP, à ddCTP, à ddGTP et à ddTTP).

On peut alors lire la séquence.

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